近日，骨科研究所杨惠林教授、耿德春教授团队的论文“Dnmt3a-mediated hypermethylation of FoxO3 promotes redox imbalance during osteoclastogenesis.”在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，PNAS上在线发表。张巍博士为论文第一作者，杨惠林教授和耿德春教授为论文的通讯作者。
骨质疏松症（OP）是最常见的全身性代谢性骨骼疾病，以骨量减少和骨强度降低为特征。异常的破骨细胞活化会导致过度骨吸收和骨稳态失衡，调控破骨细胞的异常活化能够减少骨丢失、缓解骨质疏松。然而，其具体机制尚不清楚。
叉头框蛋白O（FoxO）是核心转录因子，调控细胞死亡、增殖、代谢及ROS清除等多种功能。哺乳动物FoxO亚类包含FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6四个成员，但其调控基因在不同组织类型中重叠较少，提示FoxOs具有高度组织与细胞谱系特异性。实际上，FoxO1、FoxO3和FoxO4在骨组织中广泛重叠表达，而FoxO6仅特异性表达于大脑发育的特定时期和区域。尽管如此，这三种FoxOs在骨骼系统中功能各异：FoxO1主要在生长早期通过对抗生长板异常调控出生后骨骼大小；FoxO4缺失对骨关节系统影响较小，但会通过骨髓源性巨噬细胞功能紊乱增加动脉粥样硬化风险；FoxO3作为长寿基因，其缺失会加剧与OP病理过程相似的骨关节炎表型及肌肉萎缩。近期研究发现，二甲双胍、槲皮素和白藜芦醇等FoxO3激动剂可有效缓解椎间盘退变、缺血再灌注损伤，抑制特发性肺纤维化并降低肿瘤耐药。然而，FoxO3在多种疾病中的保护机制尚未完全阐明。在造血干细胞、胶质细胞和肿瘤细胞中，FoxO3通过核转位诱导抗氧化应激基因Sod2和Cat的转录，缓解ROS异常蓄积。前期研究证实，调控氧化应激是减少破骨细胞数量及其骨吸收能力的重要措施。因此，深入探究FoxO3是否及如何调控异常破骨细胞生成与OP具有重要意义。
耿德春教授团队基于氧化还原失衡在异常破骨细胞生成及OP骨丢失中的作用，运用单细胞测序、基因敲除小鼠、焦磷酸测序等的方法展开系列研究，揭示了FoxO3在OP发生发展中的关键作用及其表观遗传调控机制。临床样本分析显示，FoxO3表达水平与人类骨密度呈显著正相关（r=0.5898，p<0.01），且在OVX及老年小鼠OP模型中，FoxO3的降低幅度显著大于同家族成员FoxO1/4。单细胞测序结合免疫荧光证实，FoxO3定位于TRAP+破骨细胞和F4/80+巨噬细胞，提示其可能通过调控单核/巨噬细胞向破骨细胞分化参与骨代谢失衡。
在机制层面，构建髓系特异性FoxO3敲除小鼠（Lysm-Cre；FoxO3f/f）发现，FoxO3缺失可加剧OVX和老年小鼠的骨质流失。实验数据显示，FoxO3缺陷导致骨髓微环境中ROS积累增加41.7%，骨小梁表面TRAP+成熟破骨细胞数量显著上升，同时伴随骨密度（BMD）、骨小梁数量（TB.N）和骨体积分数（BV/TV）的降低以及骨小梁分离度（Tb.Sp）的增加。这一表型在体外实验中同样得到验证：FoxO3敲除的骨髓巨噬细胞（BMMs）表现出破骨分化能力增强，而FoxO3过表达可显著抑制破骨标志物NFATc1/MMP9表达并降低细胞迁移/粘附功能。
进一步研究发现，FoxO3表达受RANKL刺激的时间依赖性调控。当RANKL作用于BMMs时，FoxO3及其下游抗氧化因子Sod2/Cat的表达水平呈现渐进性下降，同时伴随破骨细胞分化能力增强。深入机制研究表明，RANKL通过诱导FoxO3启动子区CpG岛（含324个甲基化位点）的高甲基化修饰抑制其转录活性，而DNA甲基化抑制剂RG108可有效逆转这一表观遗传修饰，恢复FoxO3表达并抑制破骨细胞生成。全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）显示，RANKL处理虽不改变整体基因组甲基化水平，但可特异性调控FoxO信号通路相关基因的甲基化状态。
研究团队进一步锁定DNA甲基转移酶Dnmt3a作为关键调控因子。RNA测序分析显示，RANKL刺激3天后BMMs中Dnmt3a表达显著上调，而siRNA沉默Dnmt3a可有效恢复FoxO3表达并抑制破骨分化。机制解析证实，Dnmt3a通过催化FoxO3启动子区的高甲基化修饰抑制其转录，该过程可被慢病毒介导的Dnmt3a敲除所逆转。值得注意的是，Dnmt3a对破骨生成的调控独立于经典RANKL/RANK/TRAF6通路，而是通过降低线粒体源性ROS积累、上调FoxO3下游抗氧化蛋白Cat/Sod2表达实现。当FoxO3被沉默时，Dnmt3a敲低带来的抗氧化效应被完全抵消，证实该调控过程具有FoxO3依赖性。
在转化医学层面，巨噬细胞特异性AAV6-Dnmt3a治疗显著改善OVX小鼠的骨微结构，使骨量增加23.5%，且该效应在FoxO3缺陷小鼠中减弱。这一发现不仅验证了Dnmt3a-FoxO3调控轴的核心地位，更为开发靶向DNA甲基化-抗氧化通路的新型抗骨质疏松疗法提供了理论依据。本研究系统阐明了FoxO3在骨代谢中的多维调控网络，为突破现有骨质疏松治疗瓶颈提供了重要的分子靶点和干预策略。
综上，本研究的主要创新发现为（1）FoxO3在OP患者、卵巢切除（OVX）小鼠及老年小鼠中表达降低；（2）骨髓单核巨噬细胞（BMMs）条件性敲除FoxO3会促进ROS蓄积、加剧破骨细胞生成，并加重OVX及老年小鼠的骨丢失；（3）DNA高甲基化抑制BMMs中FoxO3表达，而去甲基化可调节破骨细胞分化并延缓骨质疏松进程；（4）敲低BMMs中的DNA甲基转移酶Dnmt3a可通过FoxO3依赖方式挽救其抗氧化能力。这些结果表明，Dnmt3a介导的FoxO3抑制是异常破骨细胞生成的关键机制，为OP治疗提供了表观遗传学干预策略。
文章题目：Dnmt3a-mediated hypermethylation of FoxO3 promotes redox imbalance during osteoclastogenesis
文章网址：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2418023122
